藥明康德內(nèi)容團(tuán)隊(duì)推出細(xì)胞和基因療法系列科學(xué)講座，邀請(qǐng)細(xì)胞和基因療法領(lǐng)域具有影響力的學(xué)者，通過(guò)視頻講座從各自角度深度解讀前沿科學(xué)進(jìn)展、呈現(xiàn)對(duì)領(lǐng)域發(fā)展的深刻洞見，共同推動(dòng)創(chuàng)新療法的研究進(jìn)展、加速為全球患者帶來(lái)突破。

在本期視頻講座中，我們邀請(qǐng)到上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授、基因編輯中心主任陳佳教授，為我們分享“新型堿基編輯技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用”。

2014年，結(jié)束了在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）的5年博士后研究后，陳佳教授在上?？萍即髮W(xué)組建了自己的實(shí)驗(yàn)室，從事DNA損傷修復(fù)機(jī)制的基礎(chǔ)研究。此時(shí)，生命科學(xué)領(lǐng)域一場(chǎng)方興未艾的技術(shù)革命吸引了陳佳教授的關(guān)注。

2012年，Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授發(fā)表了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，利用Cas9核酸內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)了特定位點(diǎn)對(duì)DNA的精準(zhǔn)切割；不到一年后，張鋒教授團(tuán)隊(duì)首次將CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)改進(jìn)并應(yīng)用于哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞。自此，人們擁有了能高效改寫DNA的“基因魔剪”。

盡管DNA損傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究與基因編輯技術(shù)看似相距甚遠(yuǎn)，但在陳佳教授看來(lái)，兩者其實(shí)暗藏著密切的聯(lián)系：“DNA的損傷修復(fù)不受我們控制，產(chǎn)生隨機(jī)的修復(fù)產(chǎn)物；相反如果我們能控制DNA損傷修復(fù)的過(guò)程，這個(gè)可控的改變就是基因編輯?！?/p>

因此，長(zhǎng)期從事基礎(chǔ)研究的陳佳教授依舊對(duì)勢(shì)頭火熱的基因編輯技術(shù)保持了開放的心態(tài)。而最終促使陳佳教授轉(zhuǎn)變研究方向的，是堿基編輯技術(shù)的出現(xiàn)。

從基礎(chǔ)到技術(shù)：打造改寫堿基的“筆”

毫無(wú)疑問(wèn)，CRISPR/Cas9基因編輯具有跨時(shí)代的意義，但這項(xiàng)技術(shù)在臨床治療中也存在著難以克服的安全隱患。由于核酸酶在編輯時(shí)需要首先切斷DNA雙鏈，這個(gè)過(guò)程中的任何錯(cuò)誤——無(wú)論是染色體的缺失、易位，還是識(shí)別錯(cuò)堿基序列導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)——以及DNA雙鏈斷裂本身導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡或癌變，都可能讓基因編輯成為孕育著危險(xiǎn)的溫床。

2016年，哈佛大學(xué)劉如謙（David Liu）教授提出了全新的堿基編輯理念（Komor et al.，Nature，2016）。對(duì)于CRISPR/Cas9與堿基編輯的對(duì)比，陳佳教授用了這樣的比喻：CRISPR/Cas9需要在基因組中產(chǎn)生大片段的創(chuàng)傷再予以修復(fù)，如同是一場(chǎng)傷筋動(dòng)骨的手術(shù)；而堿基編輯則是“化刀為筆”，不再用“手術(shù)刀”來(lái)剪切DNA，而是直接用“筆”改寫錯(cuò)誤的字母，也就是堿基。因此，堿基編輯有機(jī)會(huì)從根本上避免DNA雙鏈斷裂帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)基因突變進(jìn)行更為精準(zhǔn)的定點(diǎn)校正。

根據(jù)改寫的堿基不同，堿基編輯器包含胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE）兩類。其中，胞嘧啶堿基編輯使用的“筆”是胞嘧啶脫氨酶，這種酶能夠?qū)悬c(diǎn)處的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。而陳佳教授研究的，恰好是這支“筆”的工作機(jī)制。

▲胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器的工作原理

（圖片來(lái)源：Wang et al.，Molecular Cancer，2022）

“由于堿基編輯與我之前做的胞嘧啶脫氨酶損傷修復(fù)機(jī)制關(guān)聯(lián)性非常強(qiáng)，當(dāng)時(shí)我想可以嘗試進(jìn)行工具的研發(fā)。嘗試之后我發(fā)現(xiàn)生物技術(shù)方向相當(dāng)適合，于是我就逐漸地將實(shí)驗(yàn)室的重心從純基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)變成基于機(jī)制研究的生物技術(shù)研發(fā)。”在陳佳教授看來(lái)，內(nèi)心的喜好加上合適的時(shí)機(jī)，最終決定了自己的科研方向。

攻克脫靶效應(yīng)：源自意外的發(fā)現(xiàn)

在此后數(shù)年間，陳佳教授團(tuán)隊(duì)與合作者先后開發(fā)出了具有高編輯效率與高產(chǎn)物純度的增強(qiáng)型堿基編輯器（enhanced Base Editor，eBE）、能在基因組A/T富集區(qū)域內(nèi)精準(zhǔn)編輯的Cpf1（一種與Cas9互補(bǔ)的新型蛋白）的堿基編輯器、在G/C富集區(qū)域和高甲基化DNA區(qū)域內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效編輯的hA3A堿基編輯器，以及將Cpf1與hA3A結(jié)合，能避免激活細(xì)胞DNA損傷響應(yīng)通路，從而避免細(xì)胞凋亡的堿基編輯系統(tǒng)BEACON。

這些全新的突破提升了堿基編輯的準(zhǔn)確性、效率與安全性，拓展了堿基編輯工具的應(yīng)用范圍。但此時(shí)的堿基編輯技術(shù)還面臨著一項(xiàng)全球科學(xué)家尚未攻克的重大障礙，那就是大規(guī)模的脫靶效應(yīng)。

胞嘧啶堿基編輯器包括兩個(gè)核心元件：識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn)的定位器（locator）——向?qū)NA（guide RNA），以及執(zhí)行堿基替換的效應(yīng)器（effector）——胞嘧啶脫氨酶。理想情況下，胞嘧啶脫氨酶應(yīng)該僅在目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)揮作用，但由于其高結(jié)合活性，這種裸露在外的酶既能在guide RNA的介導(dǎo)下在脫靶位點(diǎn)產(chǎn)生脫氨反應(yīng)（稱作guide RNA依賴性突變），也可以在不依賴于guide RNA的情況下，在基因組DNA隨機(jī)產(chǎn)生的單鏈區(qū)域進(jìn)行脫氨反應(yīng)（即guide RNA非依賴性突變）。這兩種脫靶突變，尤其是后者很難被檢測(cè)到，可能帶來(lái)嚴(yán)重的后果。

為了解決脫靶的難題，陳佳教授團(tuán)隊(duì)最初的設(shè)計(jì)思路是將胞嘧啶脫氨酶拆成兩部分，它們單獨(dú)存在時(shí)不具備活性，只有兩者結(jié)合才能進(jìn)行脫氨反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)靶向編輯的目標(biāo)。

但實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻向研究團(tuán)隊(duì)潑了一盆冷水。他們將胞嘧啶脫氨酶拆開后，發(fā)現(xiàn)胞嘧啶脫氨酶的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域成為了另一部分的抑制劑。回憶這段實(shí)驗(yàn)歷程時(shí)，陳佳教授告訴我們，看到結(jié)果嚴(yán)重偏離預(yù)期，他當(dāng)時(shí)也感到很難過(guò)。但他們很快意識(shí)到，這個(gè)意外出現(xiàn)的抑制劑，恰好可以用作胞嘧啶脫氨酶的“鎖”，限制其在靶向位點(diǎn)以外的活性。

tBE的誕生：實(shí)現(xiàn)“零脫靶”

基于這一思路，陳佳教授團(tuán)隊(duì)與合作者開發(fā)出了名為變形式堿基編輯器（transformer Base Editor，tBE）的新型堿基編輯工具，并在2021年通過(guò)Nature Cell Biology期刊發(fā)表了這項(xiàng)突破性進(jìn)展。

陳佳團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，自然界天然存在胞嘧啶脫氨酶的抑制劑，相當(dāng)于給胞嘧啶脫氨酶上鎖，同時(shí)避免了上述兩類脫靶突變。當(dāng)然，只有鎖還不夠。到達(dá)目標(biāo)位點(diǎn)后，還需要解開這把鎖，從而恢復(fù)脫氨酶的活性。為此，研究團(tuán)隊(duì)的策略是直接將鎖切斷。他們?cè)谝种苿┖桶奏っ摪泵钢g添加了一個(gè)蛋白酶的酶切位點(diǎn)，它可以在靶向位點(diǎn)處將鎖切掉，達(dá)到了“解鎖”的目的。

基于這一系列的設(shè)計(jì)，胞嘧啶脫氨酶僅在靶向位點(diǎn)處進(jìn)行非常高效、精準(zhǔn)的編輯，避免在脫靶位點(diǎn)處產(chǎn)生任何突變。

“一些特別關(guān)鍵的技術(shù)往往不是我們計(jì)劃好的，而是偶然發(fā)現(xiàn)的?！睂?duì)于這項(xiàng)最初源于意外的突破，陳佳教授談到。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對(duì)于guide RNA依賴性與非依賴性脫靶突變，tBE都完全實(shí)現(xiàn)了零脫靶?！?strong>我們的tBE消除了所有的脫靶，同時(shí)還能保證它非常高效的靶向編輯，這是一項(xiàng)非常不容易的成果。”

tBE的下一步

陳佳教授實(shí)驗(yàn)室的一系列堿基編輯工具已經(jīng)申請(qǐng)、獲得了多項(xiàng)國(guó)際與中國(guó)的專利授權(quán)。其中，tBE已經(jīng)獲得了美國(guó)、中國(guó)、澳大利亞等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的專利授權(quán)。據(jù)陳佳教授介紹，相對(duì)于現(xiàn)有的堿基編輯系統(tǒng)，tBE在臨床治療的應(yīng)用范圍得到極大的擴(kuò)展。tBE既能搭配腺相關(guān)病毒（AAV）、脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等多種體內(nèi)遞送方式，大幅提升體內(nèi)的編輯效率；也能通過(guò)電轉(zhuǎn)等方式在體外抽提的造血干細(xì)胞中進(jìn)行高效的編輯。此外，tBE還可以結(jié)合CAR-T細(xì)胞療法，在T細(xì)胞里進(jìn)行雙靶點(diǎn)甚至多靶點(diǎn)的高效編輯。

目前，tBE已經(jīng)在臨床應(yīng)用中體現(xiàn)功效。例如，tBE對(duì)β-地中海貧血等罕見病已經(jīng)展現(xiàn)出超過(guò)80%的高編輯效率，其中治療β-地中海貧血的管線正在系統(tǒng)進(jìn)展，相比于傳統(tǒng)Cas9核酸酶基因編輯技術(shù)展現(xiàn)出更為優(yōu)異的療效和安全性。此外，利用tBE協(xié)助腫瘤免疫治療、增強(qiáng)CAR-T療效、治療傳染性疾病等管線的開發(fā)均在進(jìn)行中，體現(xiàn)出靶向編輯效率高且無(wú)脫靶現(xiàn)象的優(yōu)勢(shì)。

“接下來(lái)，我們希望將tBE的理念應(yīng)用到更多編輯工具中，在tBE之外開發(fā)出其他高精度的新型編輯器；另一方面，我們希望在遞送方面實(shí)現(xiàn)突破，例如實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的組織器官特異性遞送?！背松鲜龆唐趦?nèi)希望看到的突破，陳佳教授還展望了更長(zhǎng)遠(yuǎn)的未來(lái)：如果能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段的定點(diǎn)插入、在指定器官內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)基因編輯，未來(lái)的基因療法將迎來(lái)顛覆性的變化。

過(guò)去十年，基因編輯技術(shù)的發(fā)展改變了陳佳教授的研究方向，而他開發(fā)的工具正在進(jìn)一步推動(dòng)基因編輯的應(yīng)用，為基因編輯的前景開辟出更多可能性。在陳佳教授看來(lái)，研究方向的變化改變了他的思維方式，使得他在好奇心驅(qū)動(dòng)之余也會(huì)從疾病與臨床需求的角度思考，尋找具有轉(zhuǎn)化潛力的課題。而對(duì)于面臨方向選擇的年輕學(xué)生，陳佳教授也給出了自己的建議：關(guān)注自己的內(nèi)心喜歡什么、保持open mind，為自己的科研生涯預(yù)留多幾個(gè)選項(xiàng)。

參考資料：[1] Wang, L., Xue, W., Zhang, H. et al. Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations. Nat Cell Biol 23, 552–563 (2021). 

https://doi.org/10.1038/s41556-021-00671-4[2] Komor, A., Kim, Y., Packer, M. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016). 

https://doi.org/10.1038/nature17946[3] Wang, SW., Gao, C., Zheng, YM. et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer 21, 57 (2022). 

https://doi.org/10.1186/s12943-022-01518-8